Test per il dosaggio della proteina PD-L1

Risultato della ricerca:

La ricerca che s’intende avviare al percorso di valorizzazione riguarda l’identificazione e la caratterizzazione di n. 6 peptidi sintetici che agiscono da antagonisti della via di segnalazione cellulare PD-1(recettore)/PDL1(ligando).

Questa via di segnalazione cellulare fa parte dei meccanismi di “checkpoint immunitari” che garantiscono l’omeostasi fisiologia della risposta immunitaria acquisita e contribuiscono alla tolleranza immunologica verso i tumori. L’importanza dell’asse PD-1/PD-L1 è
sottolineata dallo straordinario successo dell’immunoterapia basata sugli anticorpi monoclonali in grado di bloccare la via segnalazione dei checkpoint immunitari e così riattivare la risposta anti-tumorale.

I peptidi identificati dalla nostra ricerca sono capaci di (a) legare specificamente la proteina PD-L1 umana; (b) bloccare l’interazione di PD-L1 col suo recettore naturale PD-1; (c) modulare la risposta immune regolata negativamente dal recettore PD-1 (ref.1). Questi peptidi hanno un potenziale sia terapeutico, in relazione al potenziamento della risposta immunitaria nelle patologie tumorali e infettive croniche, sia diagnostico, grazie alla capacità di rilevare la proteina umana PD-L1 in campioni biologici.

La nostra proposta di valorizzazione riguarda specificamente l’aspetto diagnostico dei peptidi sintetici ligandi di PDL1, con un potenziale applicativo nell’ambito dei test di accompagnamento delle immunoterapie, e altro. I peptidi ligandi di PD-L1 sono stati identificati mediante l’analisi di librerie peptidiche combinatoriali su fagi (Phage Display, ref.2), usando la proteina ricombinante umana PD-L1 come “esca” di selezione.

La prima fase di selezione per affinità ha consentito di identificare 6 distinte sequenze peptidiche. A partire da queste sequenze, sono stati progettati e sintetizzati peptidi aggiuntivi caratterizzati dalla presenza di uno spaziatore amminoacidico flessibile all’estremità carbossi-terminale dei peptidi originari. Questa modificazione ha consentito da un lato di conservare la capacità dei peptidi di legare PD-L1, e dall’altro di coniugare i peptidi con la biotina, mediante un processo di biotinilazione, a livello della regione spaziatrice GGGS, agevolando la rivelazione del legame peptide/PD-L1 mediante i noti sistemi di rilevazione biotina/streptavidina. Le forme biotinilate dei peptidi ligandi PD-L1 sono state utilizzate per l’analisi di specificità di legame peptidi/PD-L1 e della forza di legame. Mediante saggi di competizione di legame in vitro abbiamo anche dimostrato che i nostri peptidi ligandi di PD-L1 riconoscono siti distinti di legame di PD-L1.

Infine, i peptidi sono stati utilizzati per la messa a punto di un metodo immuno-enzimatico per il dosaggio della proteina PD-L1 sierica che ha evidenziato un’ottima sensibilità analitica, al di sotto delle capacità analitiche dei testi prevalentemente immunometrici oggi in commercio.

Nel recente passato, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato la grande versatilità strutturale (presentazione monomerica o multimerica) e funzionale (coniugazione con biotina, fluorofori, radionuclidi) dei peptidi ligandi di recettori cellulari identificati mediante Phage Display (esempio, rif. 3). Questa versatilità potrebbe portare ad applicazioni diagnostiche aggiuntive rispetto a quella già dimostrata per nostri peptidi ligandi di PDL1.
Area di Innovazione: Scienze della Vita. Il risultato della ricerca è coerente con la seguente Traiettoria Tecnologica della S3 Calabria: Nuove metodologie diagnostiche per le malattie croniche e complesse e nuove formulazioni farmaceutiche.

La ricerca riguarda, infatti, lo sviluppo di uno strumento diagnostico affidabile ed economico per la diagnostica precoce, il monitoraggio e la valutazione di efficacia delle immunoterapie oncologiche, utilizzando, come biomarcatori specifici, peptidi ligandi di PD-L1 d’invenzione del gruppo proponente, e che possono offrire una più ampia possibilità diagnostica “in vitro” e “in vivo”. La valorizzazione della ricerca potrà consentire lo sviluppo di un kit diagnostico, che prevede una pipeline di produzione (es. sintesi e modificazione di peptidi; produzione e purificazione di proteina standard e anticorpi) e di validazione che è ancora molto debole nel sistema produttivo della Regione Calabria.
Lo stadio di sviluppo attuale della ricerca è TRL 4 – Validazione in laboratorio del concetto.

Dallo sviluppo del concetto, si è svolta ricerca applicata su tecnologie esistenti che ha consentito di sviluppare un test diagnostico immuno-enzimatico per il dosaggio di PD-L1 plasmatico, in cui i peptidi d’invenzione agiscono nella fase di cattura della proteina target alla fase solida. Il test è stato utilizzato in un’applicazione pratica di dosaggio della proteina sierica PD-L1 in 23 campioni di donatori sani, rivelando un’ottima sensibilità analitica.

Riferimento a finanziamenti precedenti:

La ricerca non è stata supportata da finanziamenti precedenti.
La ricerca è stata supporta da Biotecnomed, una società consortile composta da Enti Pubblici di Ricerca e da Piccole, Medie e Grandi Imprese, soggetto gestore del Polo di Innovazione Tecnologie della Salute della Regione Calabria

Innovatività rispetto a soluzioni già esistenti:

Ad oggi, i kit diagnostici per il dosaggio di PD-L1 plasmatico disponibili sul mercato, o descritti nella letteratura scientifica, fanno uso di sistemi di cattura e rivelazione basati su anticorpi mono/policlonali.

Il kit diagnostico oggetto della ricerca proposta fa uso di un sistema di cattura in fase solida basato su piccoli peptidi, i quali hanno un costo di produzione fortemente ridotto rispetto a quello degli anticorpi mono/policlonali. Inoltre, i peptidi d’invenzione hanno una massa molecolare media di 1-2 kDa, dimensioni inferiori mediamente di 75-150 volte rispetto agli anticorpi mono/policlonali di altri kit.
Questo implica che a parità di superficie della fase solida i peptidi garantiscono una maggiore densità di cattura, che a sua volta si esprime in un numero maggiore di siti di legame per PD-L1 per unità di superficie della fase solida.

Dal punto di vista analitico, questa caratteristica determina un numero maggiore di molecole di PD-L1 catturate e, di conseguenza, una migliore sensibilità analitica del kit diagnostico oggetto della ricerca rispetto ad altre soluzioni. Poiché i peptidi d’invenzione legano siti distinti della proteina target PD-L1, il kit può essere ottimizzato, eliminando completamente la necessità di anticorpi nella fase di rivelazione, e riducendo notevolmente i tempi di analisi

Titoli di proprietà intellettuale:

I risultati della ricerca sono stati oggetto di Domanda di brevetto d’invenzione depositata in data 13 mar 2018 al n. 102018000003470, concesso in data 27 mar 2020 al n. 102018000003470 per:

PEPTIDE AND USES THEREOF; TITOLARE: BioTecnoMed – Società Consortile a Resp. Limitata 100.0%; INVENTORE: PALMIERI Camillo, et al.

Referenze citate nel documento.
1. Brevetto d’invenzione n. 102018000003470 per: PEPTIDE AND USES THEREOF.
2. Mimmi S. et al. Phage Display. Trends Pharmacol Sci. 2019;40(2):87-91.
3. Palmieri C. et al. Blood. 2010:15;116(2):226-238.

Principali applicazioni e mercato di riferimento:

– Test di accompagnamento o diagnostica complementare per l’immunoterapia basate su anticorpi monoclonali anti-PD-1/PD-L1 in una varietà di tumori, nonché per il monitoraggio della risposta clinica in tempo reale durante il trattamento.
– Test per score prognostico e/o predittivo di risposta a immunoterapie e/o terapie convenzionali.
– Test prognostico per malattie autoimmunitarie e virali.

Mercato globale per la diagnostica immuno-oncologica, in forte espansione soprattutto grazie al successo degli inibitori dei checkpoint immunitari.

Esigenze per l’ulteriore sviluppo – Industrializzazione:

– Sintesi, modificazione, purificazione di peptidi (lunghezza, 10-15 amminoacidi).
– Ottimizzazione della fase di adsorbimento dei peptidi su fase solida; valutazione di supporti alternativi alle comuni micropiastre.
– Proteina standard PD-L1: produzione, purificazione, caratterizzazione biochimica della qualità e della stabilità. Ottimizzazione della funzione di calibrazione. Materiali di controllo.
– Ottimizzazione della fase di rivelazione colorimetrica; valutazione di alternative in chemiluminescenza o fluorescenza.
– Validazione pre-analitica (siero/plasma altri fluidi biologici; interferenze; trasporto, conservazione, stabilità dell’analita nel campione biologico; etc.).
– Validazione analitica: sensibilità e specificità analitiche, intervalli di riferimento; analisi ROC per cut-off per popolazioni di riferimento